Latérale ultrasensible

May 02, 2023

Nature Biomedical Engineering (2023)Citer cet article

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Les tests à flux latéral (LFA) sont rapides et peu coûteux, mais ils sont près de 1 000 fois moins sensibles que les tests en laboratoire. Ici, nous montrons que les nanotiges d'or fluorescentes conjuguées à des anticorps plasmoniquement actifs peuvent rendre les LFA conventionnels ultrasensibles. Avec des temps entre l'échantillon et la réponse en moins de 20 minutes, les LFA à amélioration plasmonique lues via un scanner à fluorescence de paillasse standard ont atteint des améliorations d'environ 30 fois de la plage dynamique et des limites de détection sur des tests d'immuno-absorption enzymatique de référence de 4 h de long, et a atteint une sensibilité clinique de 95 % et une spécificité de 100 % pour les anticorps dans le plasma et pour les antigènes dans les écouvillons nasopharyngés d'individus atteints du syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Des améliorations comparables des performances du test peuvent également être obtenues via un scanner portable peu coûteux, comme nous le montrons pour la détection de l'interleukine-6 ​​dans des échantillons de sérum humain et de la protéine nucléocapside du SRAS-CoV-2 dans des échantillons nasopharyngés. Les LFA plasmoniquement améliorés surpassent les tests de laboratoire standard en termes de sensibilité, de vitesse, de plage dynamique, de facilité d'utilisation et de coût, et peuvent offrir des avantages dans les diagnostics au point de service.

Les tests de flux latéral (LFA) sont parmi les méthodes de diagnostic au point de service (POC) les plus simples, les plus rapides et les moins chères, et offrent un large potentiel pour le dépistage de la maladie au niveau de la population1,2. Bien que de nombreux LFA pour les anticorps3,4,5 et antigènes6,7 du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2) aient été introduits, aucun n'a une sensibilité et une quantification comparables aux diagnostics en laboratoire tels que la PCR en temps réel avec transcription inverse (RT-PCR) et dosage immuno-enzymatique (ELISA)8,9,10. En général, les LFA colorimétriques conventionnels sont environ 1 000 fois moins sensibles que ces tests de laboratoire standard11,12, et le diagnostic à l'aide des LFA nécessite un test de confirmation supplémentaire en laboratoire pour établir correctement les résultats négatifs. Les LFA colorimétriques sont souvent inadéquats pour les lectures quantitatives, en raison de changements de couleur limités par rapport à la variation de la concentration de l'analyte cible13.

La pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a mis en évidence la nécessité d'améliorer les LFA pour des diagnostics cliniques précis et rapides, des dépistages de masse et des études épidémiologiques14,15. La RT-PCR16,17 et les tests antigéniques directs18,19 ont été le pilier du diagnostic de la COVID-19, et les tests sérologiques sont importants pour la détermination du stade de l'infection et de l'efficacité du vaccin, ainsi que pour les études épidémiologiques3,20,21. Ces tests de diagnostic ne sont disponibles que dans des laboratoires de microbiologie qualifiés et restent dépendants d'experts, à forte intensité de main-d'œuvre et de temps. Ces limitations ont empêché les millions de tests par jour qui sont nécessaires pendant les poussées épidémiologiques22,23. Par conséquent, il existe un besoin critique d'outils de diagnostic et de dépistage qui sont non seulement aussi précis que les tests en laboratoire, mais aussi rapides, faciles à utiliser, peu coûteux, facilement disponibles (pour une utilisation à domicile et au POC) et évolutifs pour une population rapide. -niveau de dépistage.

Les efforts visant à améliorer les performances bioanalytiques des LFA ont inclus l'utilisation de molécules fluorescentes ou de points quantiques comme éléments rapporteurs24,25. Bien que les reporters fluorescents améliorent la quantification, leur intensité de signal relativement faible limite leur sensibilité et leur utilité de diagnostic POC, et leur faible absorption de la lumière par rapport aux nanoparticules d'or colloïdales conventionnelles (AuNP)26 empêche la détection visuelle directe que permettent les LFA conventionnels. De plus, ils nécessitent l'utilisation de lecteurs LFA avec des détecteurs très sensibles ou de puissantes sources lumineuses d'excitation. Ces considérations limitent l'utilité des LFA fluorescents dans le dépistage de masse et les ressources limitées10.

Nous envisageons un LFA « bimodal » dans lequel un dépistage initial peut être effectué avec un test visuel et des tests quantitatifs ultérieurs peuvent être effectués si nécessaire sur la même bande LFA à l'aide d'un lecteur de fluorescence. Pour y parvenir, nous avons utilisé une construction nanométrique fluorescente ultrabrillante que nous avons récemment introduite27, appelée fluor plasmonique, en tant que rapporteur bimodal colorimétrique et fluorescent dans les LFA (Fig. 1a). Ces constructions à l'échelle nanométrique exploitent la fluorescence améliorée par le plasmon28,29,30,31,32 pour obtenir un signal de fluorescence près de 7 000 fois plus lumineux que les fluorophores moléculaires conventionnels. Nous avons conjugué des fluors plasmoniques avec des anticorps de détection et les avons utilisés pour permettre une détection colorimétrique et fluorescente rapide et ultrasensible des analytes, en utilisant l'interleukine-6 ​​humaine (IL-6) (limite de détection (LOD), 93 fg ml-1), SARS-CoV -2 anticorps S1 (sous-unité de la protéine de pointe) (LOD, 185 pg ml-1) et protéine de l'antigène SARS-CoV-2 (nucléocapside (N)) (LOD, 212 pg ml-1). Nous avons validé l'efficacité clinique des LFA à base de fluor plasmonique (p-LFA) en testant des échantillons de plasma, de sérum et d'écouvillonnage nasopharyngé (NP) pour la détection des anticorps SARS-CoV-2 S1, IL-6 et SARS-CoV- 2, respectivement, et ont atteint une spécificité et une sensibilité cliniques élevées. Nous démontrons également la capacité quantitative de p-LFA à l'aide d'un scanner portable auto-conçu compatible avec le fluor plasmonique pour démontrer son application POC polyvalente. En substance, cette technologie peut être facilement déployée comme alternative à un test en laboratoire pour le diagnostic d'infections pathogènes cliniquement pertinentes.

a, Illustration schématique du fluor plasmonique, utilisé comme nanomarqueur bimodal (colorimétrique + fluorescent) dans les LFA, comprenant AuNR comme noyau plasmonique, couche de polymère comme espaceur, fluorophores moléculaires (800 CW) et biotine comme élément de reconnaissance. b,c, Image en microscopie électronique à transmission des AuNPs (b) et des fluors plasmoniques (c). d, valeurs de gris moyennes obtenues à partir d'une membrane de nitrocellulose coulée en goutte avec différentes concentrations d'AuNPs. En médaillon : l'image traitée par ImageJ 8 bits de la membrane de nitrocellulose. e,f, Intensités de fluorescence obtenues à partir d'une membrane de nitrocellulose coulée en goutte avec différentes concentrations de fluors plasmoniques (e) et de fluorophores moléculaires (f). Encarts : l'image de fluorescence correspondante de la membrane de nitrocellulose. g, valeurs de gris moyennes obtenues à partir de membranes de nitrocellulose, avec de la BSA biotinylée utilisée comme ligand de capture sur les sites de test, après exposition à différentes concentrations de AuNPs conjugués à la streptavidine. Encart : illustration schématique des AuNP conjugués à la streptavidine. h, Intensités de fluorescence obtenues à partir de membranes de nitrocellulose, avec de la BSA biotinylée comme éléments de reconnaissance sur les sites de test, après exposition à différentes concentrations de fluors plasmoniques conjugués à la streptavidine. En médaillon : illustration schématique de fluors plasmoniques conjugués à la streptavidine. Les flèches violettes indiquent le sens d'écoulement des nanoconjugués. Les données sont moyennes ± sd ; n = 4 tests répétés. Les schémas ont été créés avec BioRender.com.

Les fluors plasmoniques ont d'abord été appliqués pour surmonter trois limitations fondamentales des AuNP de 30 à 40 nm utilisés comme marqueurs colorimétriques conventionnels dans les LFA. Les AuNPs ont un faible taux de capture (<5%), un faible rapport signal sur fond et donc une sensibilité relativement faible33,34. Même avec l'utilisation d'AuNPs de 100 nm, dont il a récemment été démontré qu'ils amélioraient la sensibilité de la LFA35, ces problèmes persistent. En raison de ces trois limitations, les changements de couleur dans les LFA à base d'AuNP sont limités à une analyse qualitative ou simplement à une sortie binaire, indiquant la présence ou l'absence de l'analyte cible.

Pour évaluer si les fluors plasmoniques (longueur 98 ± 8,7 nm, diamètre 29,2 ± 3,1 nm) pouvaient surmonter ces limitations, nous avons comparé leurs performances avec les AuNPs (diamètre 104 ± 13,4 nm) sur une membrane de nitrocellulose. La longueur d'onde de résonance plasmonique de surface localisée des fluors plasmoniques (et du noyau de la nanotige d'or (AuNR)) a été réglée pour correspondre aux longueurs d'onde d'excitation et d'émission des fluorophores moléculaires27 en modifiant leurs rapports d'aspect36,37, et les dimensions optimales des nanostructures ont été choisies pour maximiser l'amélioration de la fluorescence, sur la base de notre étude précédente38. Nous avons cherché à déterminer le nombre minimum d'AuNPs et de fluors plasmoniques nécessaires pour produire un signal visible ou de fluorescence détectable. Lorsque des AuNP dilués en série (Fig. 1b et Fig. 1 supplémentaire) et des fluors plasmoniques (Fig. 1c et Fig. 1 supplémentaire) de concentration connue ont été coulés en goutte sur une membrane de nitrocellulose, des accumulations d'environ 106 AuNP et de fluors plasmoniques ont été nécessaires pour produire un signal visible discernable (Fig. 1d et Fig. 2 supplémentaire). Cependant, seuls ~ 102 fluors plasmoniques étaient nécessaires pour produire un signal de fluorescence détectable (Fig. 1e et Fig. 3 supplémentaire). De plus, des accumulations d'environ 0, 6 × 106 fluorophores moléculaires (800 CW, l'unité de fluorescence des fluors plasmoniques) étaient nécessaires pour produire un signal de fluorescence détectable (Fig. 1f), indiquant un seuil de concentration ~ 6 000 fois inférieur pour un signal de fluorescence détectable avec plasmonique fluors par rapport aux fluorophores moléculaires.

Les fluors plasmoniques présentaient un signal colorimétrique presque identique à celui des AuNP (Fig. 4 supplémentaire). Le signal colorimétrique a permis une détection visuelle qualitative (à l'œil nu), évitant le besoin d'un équipement de lecture spécialisé à une concentration relativement élevée de l'analyte cible, tandis que le signal de fluorescence a permis une détection et une quantification ultrasensibles des analytes à faible abondance. Ainsi, les fluors plasmoniques fonctionnent comme des nanomarqueurs bimodaux (colorimétrique + fluorescent) et offrent une détection ultrasensible dans un dosage biologique représentatif des LFA.

Ensuite, pour comparer les performances des fluors plasmoniques et des AuNP au format LFA, nous avons utilisé l'appariement conjugué biotine-streptavidine bien caractérisé, connu pour présenter une affinité de liaison extrêmement élevée39. Les AuNPs et les fluors plasmoniques ont été fonctionnalisés avec de la streptavidine, et de la sérumalbumine bovine biotinylée (BSA) a été utilisée comme ligand de capture. Les bandes de LFA ont ensuite été soumises à différentes concentrations connues de AuNPs conjugués à la streptavidine et de fluors plasmoniques pendant 20 min (Fig. 5 supplémentaire). Les nanomarqueurs circulent le long de la membrane de nitrocellulose par capillarité et sont capturés par le ligand de capture, entraînant l'accumulation de nanoparticules au point de test. L'accumulation d'un nombre suffisant de nanomarqueurs convertit la couleur sur le site de test en rouge, indiquant un résultat positif et la présence de l'analyte cible. L'intensité moyenne en niveaux de gris du signal colorimétrique sur le site de test avec les AuNP et le signal de fluorescence avec les fluors plasmoniques augmentaient de manière monotone avec la concentration des nanomarqueurs (Fig. 1g, h). Notamment, pour les AuNP et les fluors plasmoniques, environ 107 nanoparticules sont nécessaires pour produire un signal visible discernable ; cependant, seulement ~ 103 fluors plasmoniques sont suffisants pour produire un signal de fluorescence détectable. Le seuil de concentration inférieur de quatre ordres de grandeur pour un signal détectable avec des fluors plasmoniques par rapport aux AuNP dans le format LFA est cohérent avec l'approche de coulée de goutte discutée ci-dessus. Ces résultats établissent la base fondamentale selon laquelle les fluors plasmoniques peuvent servir de nanomarqueurs ultrabrillants pour la détection ultrasensible d'analytes cibles dans un LFA.

Nous avons optimisé les performances bioanalytiques du LFA en ajustant la concentration du ligand de capture et des nanomarqueurs. Nous avons utilisé la biotine-streptavidine comme système modèle. Les AuNP et les fluors plasmoniques étaient fonctionnalisés par la biotine; la streptavidine et la BSA biotinylée ont été utilisées comme analyte cible et ligand de capture, respectivement (Fig. 6 supplémentaire). Il a été observé qu'à mesure que la concentration du ligand de capture (c'est-à-dire de la BSA biotinylée) augmentait, l'intensité moyenne des niveaux de gris et l'intensité de fluorescence du point de test correspondant aux AuNP (Fig. 7 supplémentaire) et aux fluors plasmoniques (Fig. 8 supplémentaire), respectivement, augmenté. Ces résultats suggèrent que des concentrations plus élevées du ligand de capture entraînent une meilleure intensité du signal. De plus, à mesure que le nombre de nanomarqueurs augmentait, l'intensité moyenne des niveaux de gris et l'intensité de fluorescence du point de test correspondant aux AuNP (Fig. 9 supplémentaire) et aux fluors plasmoniques (Fig. 10 supplémentaire), respectivement, augmentaient, ce qui implique une meilleure intensité du signal avec un nombre plus élevé. de nanomarqueurs. Cependant, dans les deux cas, le signal de fond (signal de la bande LFA à l'extérieur du point de capture) a également augmenté avec le nombre de nanolabels. Par conséquent, le nombre optimal de nanomarqueurs pour les LFA et p-LFA à base de AuNPs a été déterminé en soustrayant le signal de fond du signal du point de test. Comme prévu, le nombre optimal de fluors plasmoniques (1,2 × 106) était inférieur de quatre ordres de grandeur au nombre optimal d'AuNP (1,78 × 1010).

Ensuite, nous avons comparé les paramètres bioanalytiques (LOD, limite de quantification (LOQ) et plage dynamique) des LFA et p-LFA à base de biotine-streptavidine AuNPs. Il convient de noter que le signal colorimétrique, obtenu à partir des images traitées par ImageJ 8 bits de bandes LFA, à la fois des AuNP et des fluors plasmoniques, présente une LOD similaire, ce qui ne suggère aucune perte de capacités de détection visuelle dans les p-LFA (Fig. 11 supplémentaire). La LOD (définie comme la moyenne + 3σ du blanc ; σ est l'écart type) de la LFA colorimétrique a été calculée à 4,8 ng ml-1 (Fig. 12 supplémentaire, logistique à cinq paramètres). En revanche, le p-LFA fluorométrique a permis la détection jusqu'à 2,3 pg ml-1 (Fig. 13 supplémentaire, ajustement logistique à cinq paramètres), ce qui représente une amélioration d'environ 2 000 fois de la LOD. La LOQ (définie comme la moyenne + 10σ du blanc) du p-LFA fluorométrique est ~2 500 fois meilleure que la LOQ du LFA colorimétrique. En outre, le composant fluorescent du fluor plasmonique a augmenté la plage dynamique du test de trois ordres de grandeur. Par conséquent, en raison du signal de fluorescence ultrabrillant des fluors plasmoniques, les p-LFA permettent une détection ultrasensible de l'analyte cible sur une plage beaucoup plus large de concentration d'analyte.

Les cytokines sont de petites protéines (5 à 26 kDa) impliquées dans la signalisation cellulaire et l'immunomodulation et sont des indicateurs essentiels de la santé et de la maladie40. Plusieurs maladies, dont le cancer, la septicémie, le virus de l'immunodéficience humaine, l'inflammation chronique et les maladies auto-immunes, sont connues pour être associées à une dérégulation du système immunitaire, entraînant une perturbation de l'équilibre subtil entre les cytokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires41,42. Les cytokines pro-inflammatoires comprennent l'IL-1, l'IL-6, l'IL-12, le facteur de nécrose tumorale-α et l'interféron-γ, tandis que les cytokines anti-inflammatoires comprennent le facteur de croissance transformant-β, l'IL-10 et l'IL-4. La surveillance rapide de l'état immunitaire par l'analyse des cytokines sériques et le diagnostic précoce de ces maladies sont essentiels pour une intervention clinique rapide et pour inhiber la progression de la maladie. Bien que peu de LFA pour la détection de l'IL-6 aient été introduits récemment43,44, aucun n'offre une sensibilité et une quantification comparables à l'ELISA de référence. Par conséquent, nous avons utilisé l'IL-6 comme analyte cible modèle pour étudier l'applicabilité de notre p-LFA.

Des anticorps de capture d'IL-6 humains et des anticorps anti-immunoglobuline G (IgG) de mouton ont été immobilisés sur une membrane de nitrocellulose pour former respectivement des points de test et de contrôle (Fig. 2a et Fig. 14 supplémentaire). La LOD du LFA colorimétrique à base d'AuNP (Fig. 2b) et du LFA à base de fluorophore moléculaire a été calculée comme étant de 166 pg ml-1 (Fig. 2c, ajustement logistique à cinq paramètres) et de 362 pg ml-1 (Fig. 15), respectivement. En revanche, le p-LFA fluorométrique (Fig. 2d) a permis la détection jusqu'à 93 fg ml-1 (Fig. 2e, ajustement logistique à cinq paramètres), ce qui représente une amélioration de 1 785 fois de la LOD par rapport à l'AuNP- conventionnel. basées sur les LFA et au moins un ordre de grandeur supérieur aux LFA signalés précédemment43,44,45,46. La LOQ du p-LFA fluorométrique (298 fg ml-1) est 2 288 fois meilleure que la LOQ du LFA colorimétrique (682 pg ml-1). De plus, le fluor plasmonique a amélioré la plage dynamique du LFA de près de trois ordres de grandeur. Le signal colorimétrique des AuNP et du p-LFA présentait des LOD similaires, ce qui ne suggère aucune perte de capacités de détection visuelle dans les p-LFA (Fig. 2f, g et Supplémentaire Fig. 16). De plus, le signal de fluorescence des fluors plasmoniques a permis une détection ultrasensible et une analyse quantitative sur une plage beaucoup plus large de concentration d'analyte (Fig. 2e, h).

a, Illustration schématique de bandelettes IL-6 LFA comprenant un spot de test d'anticorps de capture d'IL-6 et un spot de contrôle d'IgG de mouton. b,c, Illustration schématique de l'IL-6 LFA à base d'AuNP (b) et des valeurs de gris moyennes dépendantes de la dose (c), correspondant à différentes concentrations d'IL-6, acquises à partir de ces LFA à base d'AuNP. d,e Illustration schématique de l'IL-6 p-LFA (d) et des intensités de fluorescence dose-dépendantes de l'IL-6 p-LFA (e). f, g, images à huit bits traitées par ImageJ d'IL-6 LFA basés sur AuNP (f) et d'IL-6 p-LFA (g), illustrant le mode de lecture visuelle. h, images de fluorescence des bandes IL-6 p-LFA illustrant le mode de lecture de fluorescence. i, courbes RMC pour ELISA, p-FLISA et p-LFA (voir les informations supplémentaires pour les calculs). Les lignes pointillées indiquent les seuils RMC à µ = 2 et µ = 5 ; les intersections des lignes en pointillés et des courbes RMC indiquent la plage de concentrations sur laquelle une performance quantitative spécifique du test est obtenue. Pour l'IL-6 p-LFA, µ < 2 sur une plage de concentration de 0,13 à 86,0 pg ml-1, ce qui suggère que l'IL-6 p-LFA peut distinguer les signaux correspondant à deux concentrations quelconques dans cette plage qui diffèrent d'au moins 100 % avec au moins 99 % de confiance. Les paramètres RMC pertinents sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 1. j, Stabilité de l'IL-6 p-LFA sur 7 mois, comme en témoigne l'erreur dans les estimations de concentration de la concentration d'IL-6 déduites à l'aide de quatre courbes standard différentes obtenues sur une période de 7 mois. mois. Les schémas ont été créés avec BioRender.com.

Nous avons également comparé la sensibilité et la LOD du p-LFA fluorométrique avec l'ELISA de référence et le test d'immunosorbant lié au fluor plasmonique (p-FLISA) mis en œuvre sur une plaque de microtitration (Fig. 17 supplémentaire). La LOD de p-LFA est près de 30 fois inférieure à celle de l'ELISA sandwich classique (2,9 pg ml-1) et seulement 5 fois inférieure à celle de p-FLISA (16,8 fg ml-1) (Fig. 18 supplémentaire). Cependant, le temps échantillon-réponse pour les p-LFA était de 20 min, alors que ELISA et p-FLISA nécessitent 4 h.

Pour évaluer la capacité du p-LFA fluorométrique à résoudre avec précision les changements de concentration d'IL-6 humaine, nous avons quantifié la résolution de la concentration moléculaire (RMC), une mesure récemment introduite qui indique si les changements de concentration d'analyte peuvent être discriminés avec une signification statistique47. Cette métrique est complémentaire de la LOD : alors que la faible LOD représente la plus petite concentration d'analyte pouvant être distinguée de l'arrière-plan, RMC représente le plus petit changement de concentration pouvant être discriminé avec une certitude de 99 %47. Nous avons comparé le RMC d'ELISA, p-FLISA et p-LFA pour la résolution de doubles changements de concentration d'IL-6 humaine (paramètre RMC µ = 2, ce qui signifie qu'un double changement de concentration pourrait être résolu). Les courbes RMC pour p-LFA présentaient µ ≤ 2 sur une plage de concentration de 0, 13 à 86, 1 pg ml -1, deux ordres de grandeur inférieurs à ceux d'ELISA (Fig. 2i) et presque identiques à ceux de p-FLISA. Cela suggère que l'IL-6 p-LFA peut distinguer les signaux correspondant à deux concentrations qui diffèrent d'au moins 100 % dans cette plage avec une confiance d'au moins 99 %. La fonction RMC et d'autres paramètres bioanalytiques de p-FLISA et p-LFA, répertoriés dans le tableau supplémentaire 1, indiquent que les performances du p-LFA compatible POC de 20 min sont presque identiques à celles de p-FLISA en laboratoire de 4 h.

Ensuite, pour établir la stabilité du p-LFA fluorométrique pour la détection quantitative sans utiliser d'étalons, plusieurs courbes étalons d'IL-6 ont été acquises sur une période de 7 mois (Fig. 19 supplémentaire). Toutes les courbes standard ont atteint des paramètres RMC (Fig. 20 supplémentaires) et bioanalytiques similaires, ce qui suggère une excellente répétabilité et reproductibilité. À l'aide de ces courbes standard, des concentrations d'IL-6 allant de 1 pg ml-1 à 50 pg ml-1 ont été quantifiées avec moins de 20 % d'écart (Fig. 2j et Supplémentaire Fig. 21).

Dans l'ensemble, le test POC a montré des performances comparables à celles du test en laboratoire et a montré la capacité de quantifier avec précision la concentration d'analyte sans standard. Cela n'a pas été rapporté auparavant avec la technologie LFA et confirme que les p-LFA surmontent les limitations de longue date des LFA - sensibilité limitée, faible précision et plage analytique plus petite par rapport aux tests de laboratoire et capacité de quantification limitée.

Pour évaluer le potentiel de traduction clinique de notre p-LFA, nous l'avons ensuite optimisé pour la détection des anticorps SARS-CoV-2. Un besoin pressant persiste pour des tests sérologiques sensibles, rapides et POC pour le SRAS-CoV-2, à la fois pour les études épidémiologiques et pour les études sur l'efficacité du vaccin contre le SRAS-CoV-23,20. Plusieurs LFA3,4,48 et d'autres méthodes de dosage49 utilisent la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 comme élément de reconnaissance pour la détection des anticorps du SRAS-CoV-2. En utilisant p-LFA, notre objectif était d'étendre la sensibilité et la limite de détection au-delà de la plage possible avec les tests actuels et dans la plage d'ELISA.

La sous-unité SARS-CoV-2 S1 recombinante de la protéine de pointe a été immobilisée au point de test et l'IgG de mouton a été utilisée pour le point de contrôle (Fig. 3a et Fig. 22 supplémentaire). Nous avons d'abord déterminé les paramètres bioanalytiques du LFA basé sur AuNP (Fig. 3b) et du p-LFA (Fig. 3d) pour la détection de l'anticorps SARS-CoV-2 S1. En utilisant le signal colorimétrique obtenu à partir des bandes LFA, la LOD du LFA à base d'AuNP a été déterminée comme étant d'environ 1, 05 µg ml -1 (Fig. 3c). En revanche, le p-LFA fluorométrique présentait une LOD de 185 pg ml-1 (Fig. 3e, ajustement logistique à cinq paramètres), ce qui représente une amélioration de près de 5 675 fois. De plus, comme prévu, les intensités moyennes en niveaux de gris obtenues à la fois à partir d'AuNP et de p-LFA présentaient une sensibilité similaire, ce qui ne suggère aucun compromis dans les capacités de détection visuelle (Fig. 3f, g et Supplémentaire Fig. 23). Cependant, le signal de fluorescence des fluors plasmoniques a permis une détection ultrasensible et une analyse quantitative sur une plage beaucoup plus large (quatre ordres de grandeur plus élevée) de concentration d'analyte (Fig. 3e, h). Le p-LFA fluorométrique a montré une amélioration de 165 fois de la LOD par rapport à l'ELISA sandwich classique (Fig. 3i) et une LOD comparable à la p-FLISA (Fig. 3j).

a, Illustration schématique des bandelettes LFA d'anticorps SARS-CoV-2 S1 comprenant la protéine SARS-CoV-2 S1 recombinante comme élément de capture au point de test et l'IgG de mouton au point de contrôle. b, d, Illustrations schématiques de l'anticorps LFA SARS-CoV-2 S1 à base d'AuNP (b) et de l'anticorps LFA SARS-CoV-2 S1 plasmonic-fluor (d). c, Valeurs grises moyennes dépendantes de la dose, correspondant à différentes concentrations d'anticorps SARS-CoV-2 S1, acquises à partir de LFA basé sur AuNP. e, rapport SNR dose-dépendant de l'anticorps p-LFA SARS-CoV-2 S1 réalisé en 20 min. f, g, images traitées par ImageJ à huit bits de l'anticorps SARS-CoV-2 S1 basé sur AuNP LFA (f) et de l'anticorps p-LFA SARS-CoV-2 S1 (g), illustrant le mode de lecture visuelle. h, images de fluorescence de bandes p-LFA d'anticorps SARS-CoV-2 S1, illustrant le mode de lecture de fluorescence. i,j Densités optiques et intensités de fluorescence dose-dépendantes, correspondant à différentes concentrations d'anticorps SARS-CoV-2 S1, obtenues par ELISA standard (i) et p-FLISA (j) mis en œuvre sur plaque de microtitration, réalisées en 4 h. Les schémas ont été créés avec BioRender.com.

Pour évaluer le potentiel traductionnel des p-LFA fluorométriques, nous avons testé 79 échantillons de plasma provenant d'individus positifs au COVID-19 et 48 échantillons de sérum ou de plasma anonymisés archivés qui ont été collectés avant le COVID-19 (mars à octobre 2019)50 pour la présence d'anticorps SARS-CoV-2 S1. Les 127 échantillons de plasma ont tous été dilués 500 fois et testés à l'aide de p-LFA fluorimétrique. Sur 79 échantillons positifs pour les IgG (testés positifs par ELISA), 76 ont été testés positifs (rapport signal sur bruit (SNR) ≥ SNR du blanc + 3σ du blanc) avec p-LFA, indiquant une sensibilité de 96,2 %. Tous les échantillons pré-COVID-19 ont été testés négatifs avec LFA pour les IgG SARS-CoV-2 S1, indiquant une spécificité de 100 % (tableau supplémentaire 2). Ainsi, les p-LFA pour la détection des anticorps SARS-CoV-2 offrent une applicabilité POC avec une précision comparable à l'ELISA de référence et avec une applicabilité potentielle à l'efficacité du vaccin et aux études épidémiologiques.

Ensuite, nous avons évalué le potentiel des p-LFA pour répondre au besoin critique d'un test antigénique POC SARS-CoV-2 hautement sensible et spécifique. Dans les tests sérologiques d'immunoglobulines spécifiques du virus, les réponses anticorps aux antigènes viraux sont généralement détectées au stade tardif de l'infection (7 à 14 jours après l'exposition au virus); par conséquent, les tests sérologiques d'anticorps ne permettent pas un dépistage précis des populations asymptomatiques ou des premiers stades de l'infection51. De plus, la RT-PCR, l'étalon-or actuel dans le diagnostic du COVID-19, s'est avérée très efficace pour identifier les personnes qui ont contracté le virus SARS-CoV-2 ; cependant, ils peuvent ne pas faire la distinction entre les patients infectieux et les individus non infectieux et peuvent donner des résultats faussement positifs pendant des mois même après qu'un patient se soit rétabli de la maladie52,53.

Comme les antigènes ne sont exprimés que lorsque le virus se réplique activement, les tests basés sur les antigènes peuvent avoir une meilleure corrélation avec l'infectiosité que la détection de l'ARN par RT-PCR. Les tests de détection d'antigène actuels pour le diagnostic de la COVID-19 sont évolutifs et pratiques, mais sont limités par leur précision faible et étendue54,55,56,57. Les LFA pour la détection des antigènes du SRAS-CoV-2 peuvent être l'outil le plus important pour lutter contre les épidémies d'infection en raison de leur facilité d'utilisation, de leur coût inférieur et de leur meilleure corrélation avec l'infectiosité. Actuellement, plusieurs tests antigéniques basés sur LFA6,7,58 ont été rapportés et sont largement utilisés, mais aucun n'offre la sensibilité optimale59 ; ainsi, un résultat négatif avec de tels tests chez un patient symptomatique nécessite un test RT-PCR de confirmation ou de nouveaux tests fréquents. Par conséquent, il existe un besoin urgent d'un test d'antigène POC plus sensible qui serait tout aussi fiable et précis que la méthode RT-PCR.

p-LFA a fourni la précision et la sensibilité nécessaires pour cela dans les échantillons de patients qui ont subi simultanément des tests PCR. Notre test s'est concentré sur la détection de la protéine SARS-CoV-2 N. Le test et les points de contrôle sur les bandelettes LFA ont été préparés en immobilisant des anticorps de capture de protéine N et des IgG de mouton, respectivement (Fig. 4a et Fig. 24 supplémentaire). Les signaux colorimétriques et de fluorescence obtenus à partir des p-LFA ont augmenté de manière monotone avec une augmentation de la concentration de l'étalon de protéine N (Fig. 4b, c). Cependant, la LOD et la LOQ du p-LFA fluorométrique ont été calculées comme étant près de 400 fois meilleures que la contrepartie colorimétrique, confirmant l'importance des fluors plasmoniques en tant que nanomarqueurs fluorescents ultra-brillants (Fig. 4d). De plus, le p-LFA fluorométrique a montré une amélioration de 37 fois de la LOD par rapport à l'ELISA sandwich classique et une LOD comparable à la p-FLISA (Fig. 4e et Fig. 25 supplémentaire).

a, Illustration schématique des bandelettes p-LFA de protéine N comprenant un anticorps de capture de protéine N comme point de test et une IgG de mouton comme point de contrôle. b, c, Modes de lecture colorimétrique (b) et fluorométrique (c) de p-LFA pour la détection de la protéine N. d, valeurs de gris moyennes dose-dépendantes, correspondant à différentes concentrations de protéine N, acquises à partir de p-LFA colorimétrique (noir) et SNR dose-dépendant de la protéine N fluorométrique p-LFA réalisée en 20 min (rouge). e, Densités optiques et intensités de fluorescence dose-dépendantes, correspondant à différentes concentrations de protéine N, obtenues par ELISA standard (noir) et p-FLISA (rouge) mis en œuvre sur une plaque de microtitration, réalisée en 4 h. f, comparaison du p-LFA fluorométrique (rouge) et du kit d'antigène rapide POC commercial (BD Veritor) (noir). g, SNR de la protéine N dans les échantillons d'écouvillons NP positifs pour la PCR (SRAS-CoV-2 de type sauvage) déterminés par p-LFA colorimétrique (gris), p-LFA fluorométrique (noir) et BD Veritor. h, Comparaison des p-LFA colorimétriques (gris) et fluorométriques (noirs) en termes de leur capacité à quantifier les concentrations de protéines N présentes dans les échantillons d'écouvillons NP de 35 échantillons PCR positifs (19 SARS-CoV-2 de type sauvage et 16 Delta une variante). ND, non détecté. i, le SNR de la protéine N dans les échantillons d'écouvillons NP a été testé négatif pour COVID-19 et positif pour différents coronavirus saisonniers et autres virus respiratoires. Les schémas ont été créés avec BioRender.com.

Ensuite, pour démontrer l'avantage des p-LFA par rapport à une méthode commerciale de test d'antigène POC rapide et approuvée par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis, nous avons comparé la sensibilité analytique des p-LFA avec le test BD Veritor, qui classait échantillons avec des concentrations inférieures à 50 ng ml-1 comme «présomption négative» (Fig. 4f). Cela implique que le p-LFA fluorométrique offre une sensibilité analytique presque 235 fois supérieure à celle du test antigénique commercial. p-LFA a surpassé le kit d'antigène BD Veritor approuvé par la FDA lors de l'analyse d'échantillons de patients COVID-19 positifs à la PCR (SARS-CoV-2 de type sauvage). Le kit d'antigène BD Veritor et le p-LFA colorimétrique ont correctement identifié 8 des 19 échantillons d'écouvillons NP positifs à la PCR (sensibilité analytique, 42,1 %), tandis que le p-LFA fluorométrique a correctement identifié 18 des 19 échantillons (sensibilité analytique, 94,7 %) (Fig. .4g). Treize échantillons de patients sur quatorze au stade précoce de la maladie (<10 jours depuis l'apparition des symptômes) ont été testés positifs par p-LFA fluorométrique (sensibilité de 93%), tandis que sept seulement ont été testés positifs par BD Veritor (sensibilité de 50%) (tableau supplémentaire 3). Notamment, le kit d'antigène BD Veritor approuvé par la FDA ne peut être utilisé qu'en format négatif/positif ; cependant, le p-LFA fluorométrique a permis la détection quantitative de l'analyte cible dans les échantillons de patients (tableau supplémentaire 4). Nous avons également comparé les performances quantitatives des p-LFA colorimétriques et fluorométriques. Alors que seuls 3 échantillons sur 19 étaient quantifiables (au-dessus de la LOQ) via p-LFA colorimétrique, 18 échantillons sur 19 étaient quantifiables via p-LFA fluorométrique (Fig. 4h).

Pour étayer davantage le potentiel de traduction clinique des p-LFA fluorométriques pour la détection de la protéine N, nous avons testé 16 échantillons de patients sur écouvillon NP de la variante Delta B.1.617.2 positive à la PCR (confirmée par séquençage du gène). Le p-LFA colorimétrique a détecté la protéine N dans 7 des 16 échantillons positifs pour la variante Delta, dont seulement 3 étaient quantifiables. Cependant, le p-LFA fluorométrique a détecté la protéine N dans les 16 échantillons, dont 15 étaient quantifiables (au-dessus de la LOQ) (Fig. 4h, Fig. 26 supplémentaire et Tableau supplémentaire 5). Nous avons également testé 17 échantillons d'Omicron BA.1 positifs pour la PCR (confirmés par séquençage de gènes) et avons observé que le p-LFA fluorométrique a donné des résultats positifs pour 16 des 17 échantillons de variantes d'Omicron (Fig. 27 supplémentaire et Tableau supplémentaire 6). Tous les échantillons de patients positifs à l'Omicron ont été prélevés dans un court laps de temps après l'apparition des symptômes (1 à 2 jours) et tous les patients sauf un souffraient d'une maladie très bénigne (tableau supplémentaire 7). Ces résultats établissent l'efficacité du p-LFA pour la détection précoce de la protéine N.

Au total, 52 échantillons positifs à la PCR ont été testés. Alors que seulement 15 sur 52 ont donné des résultats positifs avec le p-LFA colorimétrique, indiquant une sensibilité clinique de 28,8 %, 50 sur 52 ont donné des résultats positifs avec le p-LFA fluorométrique (SNR > moyenne + 3σ), indiquant une sensibilité analytique de 96,2 %. La sensibilité diagnostique du p-LFA pour les échantillons à faible charge virale (valeurs de seuil de cycle (CT) ≥ 25) était de 91,7 % (11 sur 12) et pour les échantillons à charge virale élevée (valeurs de CT < 25) était de 97,5 % ( 39 sur 40). Cette sensibilité diagnostique était considérablement plus élevée que celles rapportées précédemment pour les tests rapides antigène/POC SARS-CoV-2 (~80 % pour les échantillons avec des valeurs CT <25 et 20 à 40 % pour les échantillons avec des valeurs CT ≥25)7,59,60 ,61.

Enfin, pour évaluer la spécificité de p-LFA à la protéine SARS-CoV-2 N, nous avons testé 19 échantillons d'écouvillons NP PCR-négatifs. Les échantillons d'écouvillons NP négatifs comprenaient un mélange d'échantillons sains et d'échantillons testés positifs pour les coronavirus saisonniers et d'autres virus respiratoires. Tous les 19 échantillons PCR négatifs ont été testés négatifs (SNR

Enfin, pour déterminer l'applicabilité de cette technologie de biodiagnostic dans les environnements POC, nous avons validé les performances du p-LFA à l'aide d'un scanner à fluorescence portable et peu coûteux. Notez que le décalage de Stokes correspondant aux fluors plasmoniques est beaucoup plus petit (~ 15 nm) que ceux correspondant aux nanoparticules fluorescentes couramment utilisées telles que les points quantiques et les nanoparticules d'europium (centaines de nanomètres)62,63. A notre connaissance, aucun scanner de fluorescence portable et bon marché compatible avec le fluor plasmonique n'est disponible dans le commerce. Par conséquent, nous avons développé un scanner de fluorescence portable peu coûteux pour la lecture de p-LFA en utilisant des fluors plasmoniques comme nanomarqueurs. Le prototype de scanner, avec des dimensions de 25 × 25 × 19 cm (L × B × H), a été construit à l'aide de composants optiques disponibles dans le commerce (voir Méthodes pour une description détaillée ; Fig. 5a et Supplémentaire Fig. 28) . Le coût total du scanner est de 1 429 dollars américains, et le composant le plus cher est le laser, qui coûte 919 dollars américains. Il est à noter que pour toutes les mesures décrites dans ce travail, la puissance du laser (source d'excitation) a été fixée à 1% de la puissance maximale pour éviter la saturation du signal de fluorescence. Ainsi, ces composants peuvent être miniaturisés et remplacés par des composants moins coûteux pour la commercialisation. De plus, le scanner portable peut fonctionner à partir d'une batterie et peut donc être immédiatement déployé dans des environnements à ressources limitées.

a, Photographie du scanner à fluorescence portable. b, Illustration schématique de la cassette LFA utilisée dans l'étude et le flux de travail de p-LFA. S, T et C correspondent respectivement au tampon d'échantillon, à la ligne de test et à la ligne de contrôle. La flèche bleue représente la direction des mesures de fluorescence effectuées sur la cassette LFA à l'aide du scanner portable. c, Signaux positifs (noirs) et négatifs (rouges) représentatifs obtenus à l'aide du scanner portable. d, intensités de fluorescence (sphères noires) et aire sous les valeurs de courbe (sphères rouges) obtenues à partir de bandes LFA, coulées en goutte avec différentes concentrations de fluors plasmoniques, numérisées à l'aide de scanners de table et portables. e, Image traitée par ImageJ à huit bits du p-LFA colorimétrique IL-6 à bande complète illustrant le mode de lecture visuelle. f, image de fluorescence du p-LFA fluorométrique IL-6 à bande complète illustrant le mode de lecture de fluorescence. g, signal dépendant de la dose de p-LFA fluorométrique IL-6 de 15 min mesuré par des scanners de paillasse (noir) et portables (rouge). h, Courbe de régression linéaire de la concentration d'IL-6 dans des échantillons de sérum déterminée par p-LFA fluorométrique et mesurée à l'aide des scanners de paillasse et portables. i, Courbe de régression linéaire de la concentration d'IL-6 dans des échantillons de sérum déterminée par p-FLISA en laboratoire de 4 h et un scanner à fluorescence de paillasse, par rapport aux mesures effectuées à l'aide de p-LFA fluorométrique de 15 min et du scanner portable. j, Courbe de régression linéaire de la concentration de protéine N dans les échantillons d'écouvillons NP déterminée par p-LFA fluorométrique et mesurée à l'aide des scanners de paillasse et portables. Les données sont moyennes ± sd ; n = 2 × 2 tests répétés. Le schéma a été créé avec BioRender.com.

Nous avons fabriqué des LFA à bande complète avec des tampons d'échantillon et de conjugué séparés ainsi que des membranes de test et des tampons absorbants. La bande assemblée a été intégrée dans une cassette LFA standard (Fig. 5b et Fig. 29 supplémentaire). Les mesures de fluorescence ont été effectuées en déplaçant la cassette à l'aide d'un actionneur de déplacement le long du système optique du scanner portable dans le sens de la flèche bleue sur la figure 5b. Cela a produit une trace de la valeur de pixel (intensité du signal), moyennée à partir de dix images, par rapport à la longueur de déplacement de la membrane de test, prise par incréments de 100 µm (Fig. 5c). Par conséquent, un résultat positif valide a des pics au niveau des lignes de test et de contrôle, et un résultat négatif n'a un pic qu'au niveau de la ligne de contrôle. Un test sans pic au niveau de la ligne de contrôle est considéré comme un résultat invalide (Fig. 30 supplémentaire).

Tout d'abord, pour comparer les performances du scanner portable avec le scanner de paillasse, nous avons déterminé le nombre minimum de nanolabels pouvant être détectés par chaque scanner. Lorsque des fluors plasmoniques dilués en série (Fig. 5d et Fig. 31 supplémentaires) et 800 fluorophores moléculaires CW (Figs. 32 et 33 supplémentaires) de concentration connue ont été coulés en goutte sur les membranes de test, des accumulations d'environ 100 fluors plasmoniques ont été nécessaires pour produire intensité de fluorescence détectable (moyenne du blanc + 3σ) mesurée à l'aide du scanner de paillasse, et environ 200 fluors plasmoniques étaient nécessaires pour le scanner portable (Fig. 5d). Des accumulations d'environ 0, 6 × 106 fluorophores moléculaires (non plasmoniquement améliorés) étaient nécessaires pour produire une intensité de fluorescence détectable lorsqu'elle était mesurée à l'aide du scanner de paillasse ou portable. Les données acquises par le scanner portable et la méthodologie de traitement des données ultérieure sont décrites en détail dans les informations supplémentaires (Figs. 34 et 35 supplémentaires). Ces observations indiquent des performances presque identiques des scanners de paillasse et portables dans la détection du signal de fluorescence des fluors plasmoniques.

Ensuite, pour démontrer le flux de travail compatible POC de p-LFA et comparer les performances des scanners portables et de paillasse, nous avons utilisé l'IL-6 humaine comme analyte modèle. Des anticorps de capture d'IL-6 humains et des anticorps anti-IgG de mouton ont été imprimés sur une membrane de nitrocellulose pour former respectivement des lignes de test et de contrôle (Fig. 36 supplémentaire). La LOD de l'IL-6 p-LFA colorimétrique en format de bande complète (Fig. 5e) a été calculée à environ 526 pg ml-1 (Fig. 37 supplémentaire). En revanche, le p-LFA fluorométrique (Fig. 5f et Fig. 38 supplémentaire) a permis la détection jusqu'à 813 fg ml-1 (Fig. 5g en noir, ajustement logistique à cinq paramètres), mesuré à l'aide du scanner de paillasse. Notamment, avec le scanner portable, l'IL-6 p-LFA présentait une LOD similaire, 916 fg ml-1 (Fig. 5g en rouge, ajustement logistique à cinq paramètres). Les performances presque identiques des scanners de paillasse et portables ont été confirmées en comparant les courbes dose-réponse de la protéine N (données étendues Fig. 1 et figures supplémentaires 39 et 40). Notez que la LOD des LFA en bande complète est plus élevée que celle du format en demi-bande discuté ci-dessus en raison du temps plus court (15 min contre 20 min) et du plus petit volume d'analyte (70 µl contre 100 µl) disponible pour la liaison des analytes aux nanomarqueurs conjugués à l'anticorps de capture dans le format de bande complète.

Enfin, pour démontrer le potentiel de traduction clinique et l'application POC possible de p-LFA avec le scanner portable, nous avons testé 28 échantillons de sérum et 14 échantillons d'écouvillons NP provenant d'individus positifs à la PCR COVID-19 pour la détection de l'IL-6 (Extended Data Figs. 2 et 3) et la protéine N (Figs. 41 et 42 supplémentaires), respectivement. Ces échantillons ont été testés par des p-LFA de 15 min et mesurés à l'aide de scanners de paillasse et portables. Les résultats quantitatifs des scanners de paillasse et portables ont montré une excellente corrélation avec une valeur r de Pearson de 0, 97 pour l'IL-6 (Fig. 5h) et de 0, 94 pour les concentrations de protéines N (Fig. 5j et tableau supplémentaire 8). Tout aussi important, les concentrations d'IL-6 déterminées par p-LFA de 15 min et mesurées par le scanner portable présentaient également une excellente corrélation avec celles déterminées par p-FLISA en laboratoire de 4 h (valeur r de Pearson de 0, 91) (Fig. 5i et tableau supplémentaire 9).

Cette observation, ainsi que les paramètres bioanalytiques presque identiques de la courbe standard p-LFA générée à l'aide des scanners de paillasse et portables pour l'IL-6 et la protéine N, suggèrent que la sensibilité et la capacité de détection quantitative du p-LFA ne sont pas compromises par l'utilisation d'un scanner à fluorescence portable et peu coûteux. Les résultats à l'aide de ce scanner portable étaient comparables à ceux obtenus à l'aide des tests de laboratoire de 4 heures effectués à l'aide du scanner de fluorescence de paillasse coûteux et non portable. Ces résultats mettent en évidence le flux de travail simple du p-LFA et son potentiel pour le biodiagnostic dans les contextes POC.

En résumé, nous avons montré que les fluors plasmoniques peuvent servir d'élément rapporteur bimodal (colorimétrique + fluorescent) pour surmonter les limitations de longue date des LFA. Plus précisément, le p-LFA surmonte la sensibilité limitée, la faible précision, la petite plage dynamique et la capacité de quantification limitée des LFA par rapport aux tests de laboratoire. Les fluors plasmoniques ont produit un signal de fluorescence perceptible à des densités 10 000 fois inférieures à celles nécessaires dans les AuNP colorimétriques classiques. Les p-LFA pour divers analytes (IL-6, anticorps SARS-CoV-2 S1 et antigènes SARS-CoV-2) ont montré une amélioration d'environ 1 000 fois des paramètres bioanalytiques (LOD, LOQ et plage dynamique) par rapport aux LFA conventionnels. Les p-LFA offraient une détection quantitative sans standard avec une sensibilité plus de 10 fois supérieure à celle de l'ELISA de référence, avec un temps échantillon-réponse beaucoup plus court (20 min contre 4 à 6 h) et une capacité similaire à résoudre la concentration moléculaire que des tests en laboratoire. Les p-LFA pour la détection des anticorps et antigènes COVID-19 présents dans les échantillons de plasma et d'écouvillons NP ont atteint une sensibilité > 95 % et une spécificité de 100 %, ce qui montre une applicabilité clinique. Le scanner à fluorescence portable et peu coûteux que nous avons développé et optimisé pour la lecture du p-LFA était aussi efficace que le scanner de paillasse que nous utilisions. Lorsqu'elles sont appliquées à des échantillons humains d'individus positifs au COVID-19, les concentrations d'IL-6 et de protéines N mesurées pendant 15 min p-LFA à l'aide des scanners de paillasse et portables ont montré une excellente corrélation les unes avec les autres et également avec les concentrations déterminées en laboratoire. 4 h p-FLISA. Nous pensons que les p-LFA sont très attractifs pour réaliser des biodiagnostics POC qui nécessitent une détection précise et quantitative des bioanalytes. La technologie rapportée ici peut être facilement adaptée pour la détection d'autres agents pathogènes infectieux et biomarqueurs de maladies et pourrait compléter ou même remplacer les tests en laboratoire pour le diagnostic d'infections pathogènes et d'autres affections aiguës.

Un fluor plasmonique se compose d'un noyau plasmonique actif, d'un AuNR synthétisé par une méthode médiée par les graines64, d'une couche d'espacement polymère, de fluorophores et d'un élément de bioreconnaissance universel (biotine). Les fluors plasmoniques ont été synthétisés selon une procédure similaire décrite dans notre étude précédente27. La procédure détaillée par étapes est décrite dans les informations supplémentaires.

Les AuNPs stabilisés au citrate ont été synthétisés en utilisant la méthode de synthèse médiée par les graines et en utilisant le citrate comme agent réducteur. Les graines Au (~ 15 nm) ont été synthétisées comme décrit précédemment par la réf. 65. Brièvement, 20 ml de 0,25 mM de HAuCl4 (Sigma Aldrich, 520918) ont été portés à ébullition sous agitation vigoureuse à 800 rpm. Immédiatement après le début de l'ébullition de la solution, 0,2 ml de solution aqueuse de citrate de sodium à 3 % (p/v) (Sigma Aldrich, 1613859) a été ajouté et maintenu en ébullition jusqu'à ce que la couleur de la solution devienne rouge vin, indiquant la formation de graines d'Au. Ensuite, des AuNP d'environ 100 nm ont été synthétisés en utilisant de l'hydroquinone (Sigma Aldrich, H9003) comme agent réducteur pour la réduction de l'or ionique.

Les images de microscopie électronique à transmission ont été obtenues à l'aide d'un instrument à émission de champ JEOL JEM-2100F. Les spectres d'extinction des nanostructures plasmoniques ont été obtenus à l'aide d'un spectrophotomètre Shimadzu UV-1800. Les cartographies de fluorescence ont été enregistrées à l'aide du système d'imagerie LI-COR Odyssey CLx. Un appareil photo numérique (Sony cybershot DSC HX300) et le logiciel d'imagerie ImageJ 1.53e ont été utilisés pour caractériser les intensités de gris moyennes. Le lecteur de plaques SpectraMax iD3 (Molecular Devices) a été utilisé pour mesurer la densité optique en ELISA.

Pour fonctionnaliser les nanomarqueurs avec de la streptavidine (Sigma Aldrich, SA101), 1 µl de 10 mg ml-1 de streptavidine (ou BSA-biotine ou anticorps de détection) a été ajouté à 1 ml de DO1 de nanomarqueurs et incubé pendant 1 h sur un agitateur à température ambiante . Pour stabiliser les particules, 1 µl de 10 mg ml-1 de BSA (Sigma Aldrich, A7030) a été ajouté à la solution et encore incubé pendant 20 min. La protéine non liée a été éliminée en lavant la solution 4 fois avec de l'eau nanopure à pH 10 (1 ul de NaOH dans 10 ml d'eau). Enfin, les nanomarqueurs ont été redispersés dans 1% de BSA dans une solution de PBS 1 × pour une utilisation dans les LFA. Pour fonctionnaliser les nanomarqueurs avec des anticorps (IL-6 et anticorps de détection des protéines N et anti-IgG humaine), un procédé similaire a été utilisé.

Une membrane de test en nitrocellulose et des tampons absorbants avec un matériau de support adhésif (GE Healthcare, FF120HP) ont été utilisés pour fabriquer les bandelettes LFA. La membrane de test et le tampon absorbant ont été découpés en bandes de 4 mm de large à l'aide d'un coupe-papier. Pour préparer la bande LFA, une solution d'élément de bioreconnaissance (par exemple, un anticorps de capture) a été pipetée sur la membrane de test et séchée à température ambiante pendant 30 min. Ensuite, la membrane de test a été bloquée à l'aide de 3 % de BSA dans une solution de PBS 1X. Ensuite, les bandes ont été lavées avec du PBST (1 × PBS et 0, 5% de Tween20 (Sigma Aldrich, P9416)), puis séchées à température ambiante dans un dessiccateur sous vide pendant 1 h. Après séchage, des tampons absorbants (GE Healthcare, CF5) ont été assemblés sur le support adhésif en polystyrène à côté de la membrane de test en nitrocellulose. Pour assurer un transfert efficace de la solution de la membrane de test au tampon absorbant, nous avons assuré un chevauchement de 1 à 2 mm entre les deux bandes. Les expériences ont été réalisées en plongeant les LFA dans des plaques à 96 puits remplies de 100 µl d'échantillon/solutions standard pendant 20 min. Les signaux visuels des LFA ont été obtenus par une caméra numérique. Les images ont été converties en image en niveaux de gris 8 bits à l'aide d'ImageJ. Les valeurs de gris moyennes du point de test ont été calculées en faisant la moyenne des intensités de niveaux de gris du point de test obtenues à partir d'ImageJ. Les signaux de fluorescence ont été obtenus en faisant la moyenne des intensités de fluorescence des points de test obtenues à l'aide du scanner de fluorescence LI-COR Odyssey CLx en utilisant les paramètres de balayage suivants : puissance laser, ~ L2 ; résolution, 21 µm; canal, 800 nm; hauteur, 0 mm.

Pour déterminer la concentration optimale de BSA biotinylé sur le point de test, différentes bandelettes LFA avec des concentrations variables de BSA biotinylé (100 µg ml-1 à 5 mg ml-1) ont été préparées en double. Les LFA ont ensuite été soumis à la même concentration de streptavidine (1 000 ng ml-1 pour AuNP-LFA et 1 ng ml-1 pour p-LFA) et de nanomarqueurs biotinylés. Pour déterminer la concentration optimale des nanomarqueurs, des bandelettes LFA avec la même concentration de BSA biotinylé (5 mg ml-1) ont été préparées en double. Ces barrettes de LFA ont ensuite été soumises à la même concentration de streptavidine (1 000 ng ml-1 pour les AuNPs et 1 ng ml-1 pour les fluors plasmoniques) mais à des nombres différents de nanomarqueurs fonctionnalisés par la biotine (4,45 × 106 à 3,56 × 1010 pour les AuNPs et 1,2 × 104 à 6 × 106 pour les fluors plasmoniques). Le nombre optimal de nanomarqueurs pour les AuNPs-LFA et p-LFA colorimétriques et les p-LFA fluorométriques a été déterminé en soustrayant le signal de fond du signal du spot de test.

Des taches de test ont été formées en pipetant 0,5 µl de 5 mg ml-1 de BSA biotinylé sur la membrane de nitrocellulose. Les bandes LFA ont été assemblées comme décrit ci-dessus. Pour le LFA biotine-streptavidine à base d'AuNP et à base de fluor plasmonique, 1 µl d'AuNPs biotinylés et 1 µl de fluors plasmoniques biotinylés, respectivement, ont été mélangés avec 99 µl de différentes concentrations de solutions standard de streptavidine (0,1 pg ml-1 à 1 000 µg ml -1) en plaques 96 puits pour permettre la liaison de la streptavidine avec les nanomarqueurs biotinylés. Les bandes LFA en double ont ensuite été exposées à l'échantillon et aux solutions standard pendant 20 min.

Le kit ELISA IL-6 DuoSet humain (R&D Systems, DY206) a été utilisé dans l'étude. Pour l'IL-6 LFA à base d'AuNP, les AuNP ont été conjugués avec un anticorps de détection d'IL-6 pour le point de test et avec des IgG anti-mouton (R&D Systems, BAF016) pour le point de contrôle. Pour p-LFA, les fluors plasmoniques ont été conjugués avec un anticorps de détection IL-6 pour le point de test, et les AuNP ont été conjugués avec des IgG anti-mouton pour le point de contrôle, respectivement. Pour préparer des bandelettes LFA pour le dosage immunologique de l'IL-6, 0,5 µl de 2 mg ml-1 d'anticorps de capture d'IL-6 et 0,5 µl de 2 mg ml-1 d'IgG de mouton (R&D Systems, 5-001-A) ont été pipetés sur la membrane de nitrocellulose à différents endroits pour créer respectivement un point de test et un point de contrôle. Par la suite, des étapes similaires mentionnées ci-dessus ont été suivies pour la préparation et l'assemblage des LFA. Pour l'IL-6 LFA à base d'AuNP, 1 µl d'AuNP conjugués à l'anticorps de détection d'IL-6 et 1 µl d'AuNP conjugués à l'IgG anti-mouton pour le test et le point de contrôle, respectivement, ont été mélangés avec 98 µl de différentes concentrations d'IL-6 humaine solutions standards (64 fg ml-1 à 5 ng ml-1) dans des plaques 96 puits pour permettre la liaison de l'analyte avec les nanolabels conjugués à l'anticorps de détection. Les bandes LFA en double ont ensuite été exposées à l'échantillon et aux solutions standard pendant 20 min. Pour l'IL-6 p-LFA, 1 µl de fluors plasmoniques conjugués à des anticorps de détection d'IL-6 et 1 µl d'AuNP conjugués à des IgG anti-mouton ont été mélangés avec 98 µl de solutions étalons d'IL-6 humaine (1 fg ml−1 à 1 ng ml -1) dans des plaques 96 puits. Les signaux visuels et les signaux de fluorescence ont été obtenus selon la procédure décrite ci-dessus.

Human IL-6 ELISA a été réalisé selon la procédure décrite dans le manuel du kit DuoSet ELISA et est discuté en détail dans les informations supplémentaires. p-FLISA a été réalisé en adoptant une approche similaire, sauf que la streptavidine marquée à la HRP a été remplacée par du fluor plasmonique fonctionnalisé à la streptavidine. Au lieu de streptavidine-HRP, 100 µl de streptavidine-fluor plasmonique (OD 1) ont été incubés pendant 30 min, puis la plaque a été lavée 3 fois avec du PBST. ELISA et p-FLISA ont été réalisés en double. Le signal de fluorescence a été obtenu en faisant la moyenne des intensités de fluorescence des puits de microtitrage obtenus à l'aide de LI-COR Odyssey CLx avec les paramètres de balayage suivants : puissance laser, ~L2 ; résolution, 169 µm; canal, 800 nm; hauteur, 4 mm.

Quatre courbes standard de p-LFA IL-6 (1 fg ml-1 à 1 ng ml-1) ont été générées sur une période de 6 mois, et des échantillons avec différentes concentrations d'IL-6 (0,5 pg ml-1 à 62,5 pg ml- 1) ont été testés en double sans standard. Leurs concentrations expérimentales ont été déterminées à l'aide de chaque courbe standard et les écarts par rapport aux concentrations réelles ont été calculés.

Nous avons pipeté 0,5 µl de 2 mg ml-1 de protéine recombinante SARS-CoV-2 S1 (R&D Systems, 10522-CV) et 0,5 µl de 2 mg ml-1 d'IgG de mouton sur la membrane de nitrocellulose comme test et point de contrôle, respectivement. Par la suite, nous avons suivi les mêmes étapes décrites ci-dessus pour préparer les bandes LFA. Pour détecter les anticorps SARS-CoV-2 S1, AuNP-LFA et p-LFA, les AuNP et les fluors plasmoniques ont été conjugués avec des IgG anti-humaines biotinylées (Rockland, 609-4617) pour les points de test, respectivement. Dans les deux cas, les AuNPs ont été conjugués avec des IgG anti-mouton pour la tache de contrôle. Pour l'anticorps LFA SARS-CoV-2 S1 à base d'AuNP, 1 µl d'AuNPs conjugués à des IgG anti-humains et 1 µl d'AuNPs conjugués à des IgG anti-mouton ont été mélangés à différentes concentrations de solutions standard (16 pg ml-1 à 25 µg ml -1) en plaques 96 puits, avant exposition à la bandelette LFA pendant 20 min. Pour l'anticorps LFA SARS-CoV-2 S1 à base de fluor plasmonique, 1 µl de fluors plasmoniques conjugués à des IgG anti-humains et 1 µl d'AuNP conjugués à des IgG anti-mouton ont été mélangés à différentes concentrations de solutions étalons (16 pg ml-1 à 1 µg ml-1) dans des plaques 96 puits, avant exposition à la bandelette LFA pendant 20 min. Les échantillons de plasma ont été dilués 500 fois dans un diluant réactif (PBS 1X contenant 3 % de BSA, filtré à 0,2 µm) avant utilisation. Toutes les expériences ont été faites en double. Les signaux visuels et les signaux de fluorescence ont été obtenus en utilisant la même procédure mentionnée ci-dessus.

L'ELISA de l'anticorps SARS-CoV-2 S1 a été réalisée selon la procédure suivante. Les puits de microtitrage en double ont été recouverts de 100 µl de 5 µg ml-1 (dans 1 × PBS) de protéine recombinante SARS-CoV-2 S1 via une incubation d'une nuit à température ambiante. Pour le blocage, 300 µl de diluant réactif ont été ajoutés aux puits pendant au moins 1 h. Ensuite, 100 µl d'échantillons standard dilués en série ont été incubés pendant 2 h, suivis d'une incubation de 100 µl de 100 ng ml-1 d'IgG anti-humaine biotinylée pendant 2 h. Ensuite, 100 µl de 500 ng ml-1 de HRP marquée à la streptavidine (Thermo Fisher Scientific, N100) ont été incubés pendant 20 min, suivis de l'ajout de 100 µl de solution de substrat pendant 20 min. La réaction a été arrêtée par addition de 50 ul de H2SO4 2 N (R&D Systems, DY994) et immédiatement la densité optique à 450 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques. p-FLISA a été réalisé en adoptant une procédure similaire, sauf que la streptavidine marquée à la HRP a été remplacée par du fluor plasmonique fonctionnalisé à la streptavidine. Au lieu de HRP, 100 µl de fluor plasmonique (OD 1) ont été incubés pendant 30 min, puis la plaque a été lavée 3 fois avec du PBST. Le signal de fluorescence a été obtenu en faisant la moyenne des intensités de fluorescence des puits de microtitrage obtenus à l'aide de LI-COR Odyssey CLx.

Nous avons pipeté 0,5 µl d'anticorps de capture de protéine N de 2 mg ml-1 (SinoBiologicals, 40143-MM08) et 0,5 µl d'IgG de mouton de 2 mg ml-1 sur la membrane de nitrocellulose comme points de test et de contrôle, respectivement. Pour la protéine N p-LFA, des fluors plasmoniques ont été conjugués avec un anticorps de détection de protéine N biotinylé (SinoBiologicals, 40143-R004) pour les spots de test. Des AuNPs conjugués à des IgG anti-mouton ont été utilisés pour le spot témoin. Par la suite, des étapes similaires mentionnées ci-dessus ont été suivies pour préparer et assembler les bandes LFA. Pour le LFA de protéine N à base de fluor plasmonique, 1 µl de farines plasmoniques conjuguées à des anticorps de détection et 1 µl d'AuNP conjugués à des IgG anti-mouton ont été incubés avec différentes concentrations de solution standard (12 pg ml-1 et 1 µg ml-1 ; SinoBiologicals , 40588-V08B) dopés dans un milieu de transport universel (UTM) dans des plaques à 96 puits avant exposition aux bandes LFA pendant 20 min. Les p-LFA ont été utilisés pour la détection de la protéine N présente dans les échantillons d'écouvillons NP des patients. Les échantillons d'écouvillons NP étaient en UTM et ont été utilisés sans aucune dilution ou traitement. Toutes les expériences ont été réalisées en double. Les signaux visuels et les signaux de fluorescence ont été obtenus en utilisant le même procédé décrit ci-dessus.

L'ELISA de la protéine N a été réalisée en recouvrant d'abord les puits de microtitration en double avec 100 µl d'anticorps de capture de protéine N de 100 ng ml-1 (dans du PBS 1 ×) via une incubation d'une nuit à température ambiante. Pour le blocage, 300 µl de diluant réactif ont été ajoutés aux puits pendant au moins 1 h. Ensuite, 100 µl d'échantillons standard dilués en série ont été incubés pendant 2 h, suivis d'une incubation de 100 µl de 200 ng ml-1 d'anticorps de détection de protéine N biotinylé pendant 2 h. Ensuite, 100 µl de 500 ng ml-1 de HRP marquée à la streptavidine (Thermo Fisher Scientific, N100) ont été incubés pendant 20 min, suivis de l'ajout de 100 µl de solution de substrat pendant 20 min. La réaction a été arrêtée par addition de 50 ul de H2SO4 2 N (R&D Systems, DY994), et immédiatement la densité optique à 450 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques. p-FLISA a été réalisé en adoptant une procédure similaire, sauf que la streptavidine marquée à la HRP a été remplacée par du fluor plasmonique fonctionnalisé à la streptavidine. Au lieu de HRP, 100 µl de fluor plasmonique (OD 1) ont été incubés pendant 30 min, puis la plaque a été lavée 3 fois avec du PBST. Le signal de fluorescence a été obtenu en faisant la moyenne des intensités de fluorescence des puits de microtitrage obtenus à l'aide de LI-COR Odyssey CLx.

Le kit BD Veritor, Veritor System, pour la détection rapide du SARS-CoV-2, a été utilisé pour analyser la présence de protéine N dans les échantillons de patients. Le système BD Veritor a été utilisé conjointement avec l'analyseur BD Veritor Plus. Les écouvillons NP ont été élues dans le milieu de transport UTM et Aimes (ESwab). La validation interne et la précision du test ont été effectuées et jugées acceptables pour les tests sur des échantillons cliniques par le Barnes Jewish Clinical Microbiology Laboratory.

Les échantillons de sérum ou de plasma prélevés avant l'épidémie de COVID-19 ont été prélevés dans le cadre de l'étude approuvée par le Human Research Protection Office de l'Université de Washington à St. Louis sous HRPO 201102546. Les échantillons cliniques utilisés dans l'étude ont été acquis à partir du référentiel de salive, sérum , des échantillons de plasma et d'écouvillons NP provenant d'individus confirmés ou suspectés d'être atteints de la maladie COVID-19, situés à la Washington University School of Medicine à St Louis, et du Barnes Jewish Clinical Microbiology Laboratory ; l'acquisition d'échantillons a été soutenue par : la Barnes-Jewish Hospital Foundation ; la subvention P30 CA091842 du Siteman Cancer Center du National Cancer Institute des National Institutes of Health (NIH) ; et la subvention UL1TR002345 de l'Institut des sciences cliniques et translationnelles de l'Université de Washington du National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) des NIH. Ce référentiel a été développé et est maintenu par Jane O'Halloran, MD, PhD ; Charles Goss, PhD; et Phillip Mudd, MD, PhD. Des échantillons d'écouvillons NP de contrôle provenant de volontaires sains asymptomatiques ont été obtenus avec un consentement écrit préalable. Pour l'évaluation de la réactivité croisée avec les coronavirus saisonniers, des échantillons ont été obtenus d'adultes de l'hôpital Barnes-Jewish qui ont été testés positifs avec l'un des quatre coronavirus saisonniers ou des maladies respiratoires via des tests d'échantillons NP cliniquement justifiés. Le Bureau de protection de la recherche humaine de l'École de médecine de l'Université de Washington a approuvé l'étude. Toutes les données cliniques préexistaient au moment de la collecte des données. Une dispense de consentement préalable a été obtenue pour les informations cliniques et les données sur les résultats de la PCR COVID-19.

Les composants p-LFA à bande complète comprennent : membrane NC, FF80HP sur support en polystyrène (numéro de catalogue 10547020, de Whatman, Cytiva ); tampon d'échantillon, Fusion 5 (numéro de catalogue 8151-9915, de Whatman, Cytiva); tampon conjugué, Whatman Standard 14 (8133-2250, Cytiva); et tampon d'absorption, CF5 (numéro de catalogue 8115-2250, Cytiva). Les tampons d'échantillon et de conjugué ont été soumis au processus de prétraitement suivant : les tampons d'échantillon ont été trempés dans 5 % de BSA, 0,5 % de Tween 20 et 1 × PBS, puis séchés dans un four à 37 °C pendant 2 h. Les tampons conjugués ont été trempés dans 5 % de BSA, 10 % de saccharose, 0,5 % de Tween 20 et 1 × PBS, puis séchés dans un four à 37 °C pendant 2 h. Après le prétraitement, les tampons d'échantillon et de conjugué ont été coupés en bandes de dimensions 15 mm × 25 mm et 13 mm × 25 mm, respectivement. Les tampons d'absorption ont été utilisés tels que reçus et ont été découpés en dimensions de 18 mm × 25 mm.

Pour préparer les nanomarqueurs pour la ligne de test, 1 à 3 µl de protéine SARS-CoV-2 N biotinylée ou d'anticorps de détection de l'IL-6 humaine à une concentration de 1 mg ml-1 ont été ajoutés à 1 ml de fluors plasmoniques fonctionnalisés par la streptavidine d'extinction 2. Après 30 1 min d'incubation, 100 µl de BSA à 10 % dans du PBS 1X ont été ajoutés à cette solution de fluor plasmonique conjugué à l'anticorps. Après une autre incubation de 30 minutes, la solution de nanomarqueurs conjugués a été centrifugée 3 fois pour éliminer les anticorps de détection non liés, et la solution suivante a été redispersée dans du borate de sodium 2 mM, pH 8,5 avec 10 % de saccharose. Pour la préparation des nanomarqueurs pour la lignée témoin, 1 à 5 µl d'IgG anti-chèvre biotinylée de concentration 2 mg ml−1 ont été ajoutés à 1 ml de fluor plasmonique de streptavidine d'extinction 2. Après 30 min d'incubation, 100 µl de BSA à 10 % dans 1 × PBS a été ajouté à cette solution de conjugué anticorps-fluor plasmonique. Après une autre incubation de 30 minutes, la solution de nanomarqueurs conjugués a été centrifugée 3 fois et redispersée dans du borate de sodium 2 mM de pH 8,5 constitué de 10 % de saccharose.

Ensuite, les nanomarqueurs pour les lignes de test et de contrôle ont été mélangés dans un rapport 1:1. Ensuite, la solution résultante a été pulvérisée sur le tampon de conjugué prétraité. La solution de nanomarqueurs a été pulvérisée par jet d'air avec un débit de distribution de 5 µl cm-1 à l'aide d'un distributeur de réactifs (XYZ Platform Dispenser HM3030, Kinbio). Après avoir été pulvérisés, les tampons de conjugué ont été séchés dans un four à 37 ° C pendant 2 h. Ensuite, la membrane test a été préparée en imprimant les anticorps de capture spécifiques aux lignées test et contrôle. Pour la ligne de test SARS-CoV-2 Ag et l'anticorps de capture d'IL-6 humain de concentration de 1 mg ml-1 et pour la ligne de contrôle IgG de chèvre de concentration de 2 mg ml-1 ont été imprimés simultanément sur une membrane de test de nitrocellulose FF80HP à un taux de distribution de 0,5 µl cm-1 et vitesse de 50 mm s-1 par un distributeur de réactifs (XYZ Platform Dispenser HM3030, Kinbio). Ensuite, les membranes ont été séchées dans une étuve à 37°C pendant 2h.

Enfin, le tampon d'échantillon prétraité, le tampon de conjugué après pulvérisation de nanolabels et le tampon de membrane après impression des anticorps de capture ont été assemblés avec un chevauchement de 2 mm entre chaque tampon et découpés en bandes d'une largeur de 3 mm à l'aide d'un coupe-bande ( Coupe-bande programmable ZQ2002, Kinbio). Pour l'illustration schématique de la conception de p-LFA, reportez-vous à la Fig. 45 supplémentaire.

Un laser à diode 80 mW 785 nm (Zlaser, Z80M18S3-F-785-pe) a été utilisé comme source d'excitation. Le faisceau laser a été atténué avec un filtre de densité neutre de 1 % et façonné en une ligne de 4 mm de large en utilisant la combinaison de la commande de mise au point laser et d'une lentille plan-convexe cylindrique de longueur focale de 30 mm. La fluorescence a été recueillie avec une lentille plan-convexe de longueur focale de 30 mm (diamètre de 12,5 mm) et passée à travers un filtre d'émission de 832/37 nm (Edmund Optics, 84-107). Une lentille doublet achromatique de distance focale de 45 mm (Edmund Optics, 49-355) a été utilisée pour former une image agrandie x1,5 de la bande à flux latéral sur le capteur de la caméra (ZWO ASI462MC). La fluorescence a été mesurée à un angle de 45° par rapport à l'excitation. Les mesures à partir de cassettes à flux latéral ont été effectuées en traduisant l'échantillon (à l'aide de l'actionneur de déplacement Actuonix L16-R de 50 mm) à travers le système optique à 1 mm s-1 tout en diffusant la vidéo de la caméra. Une vidéo a été réalisée avec une exposition de 100 ms (10 images par seconde). La valeur moyenne des pixels de chacune des dix images a été utilisée pour l'analyse et correspondait à un point de la trace produite par cet instrument. Un ordinateur monocarte Raspberry Pi 4 a été utilisé pour contrôler tous les composants matériels de l'instrument.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les principales données à l'appui des résultats de cette étude sont disponibles dans le document et les informations supplémentaires. Toutes les données générées dans cette étude sont disponibles sur figshare via l'identifiant https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21556365.

Le code pour le calcul des paramètres RMC µ et RMC et les instructions sur la façon d'utiliser le code pour Langmuir et l'ajustement logistique à cinq paramètres sont disponibles sur https://github.com/seanwangsalad/PythonRMC. Le code de traitement des données du scanner portable et les instructions d'utilisation du code sont disponibles sur https://github.com/seanwangsalad/AreaUnderCurveForLFAReader.

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Nous reconnaissons le soutien de la National Science Foundation (CBET-2027145, CBET-2029105 et CMMI 1548571) et du National Cancer Institute-Innovative Molecular Analysis Technologies (R21CA236652 et R21CA236652-S1). La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par la subvention UL1TR002345 du National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) des National Institutes of Health (NIH) de l'Institut des sciences cliniques et translationnelles de l'Université de Washington. Nous remercions également le Nano Research Facility (NRF) et l'Institut des sciences et de l'ingénierie des matériaux (IMSE) de l'Université de Washington pour avoir fourni l'accès aux installations de microscopie électronique. Une partie des illustrations schématiques représentées dans les Fig. 1a, 2a, 3a, 4a et 5b ont été créés dans BioRender.com. Nous remercions H. Baldi pour son aide avec les images BioRender. Nous remercions MS Diamond, A. Ellebedy, DH Fremont et SPJ Whelan de la Washington University School of Medicine et J. Luan de la Washington University McKelvey School of Engineering pour des discussions utiles. Nous remercions GJ Weil et PU Fischer, Washington University School of Medicine, pour avoir aimablement fourni des échantillons pré-COVID-19. Les échantillons utilisés dans cette étude ont été obtenus du biodépôt COVID-19 de la Washington University School of Medicine, qui est soutenu par la Barnes-Jewish Hospital Foundation ; la subvention P30 CA091842 du Siteman Cancer Center du National Cancer Institute des NIH ; et la subvention UL1TR002345 de l'Institut des sciences cliniques et translationnelles de l'Université de Washington du NCATS du NIH. Ce référentiel a été développé et est maintenu par J. O'Halloran, C. Goss et P. Mudd. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement le point de vue du NIH.

Département de génie mécanique et des sciences des matériaux, Institut des sciences et du génie des matériaux, Université de Washington à St. Louis, St. Louis, MO, États-Unis

Rohit Gupta, Prashant Gupta, Anushree Seth, Zheyu Wang, Guy M. Genin et Srikanth Singamaneni

Département de biologie, Université de Washington à St. Louis, St. Louis, MO, États-Unis

Sean Wang

Auragent Bioscience LLC, St. Louis, MO, États-Unis

Artem Melnykov et Qisheng Jiang

Département d'anesthésiologie, Division de la recherche clinique et translationnelle, Université de Washington à St. Louis, St. Louis, MO, États-Unis

Jeremiah J. Morrissey et Pratik Sinha

Siteman Cancer Center, École de médecine de l'Université de Washington, St. Louis, MO, États-Unis

Jeremiah J. Morrissey et Srikanth Singamaneni

Département de médecine interne, Division des maladies infectieuses, École de médecine de l'Université de Washington, St. Louis, MO, États-Unis

Ige George et Sumanth Gandra

Département de pédiatrie, École de médecine de l'Université de Washington, St. Louis, MO, États-Unis

Gregory A. Storch

Département de pathologie et d'immunologie, École de médecine de l'Université de Washington, St. Louis, MO, États-Unis

Bijal A. Parikh

NSF Science and Technology Center for Engineering MechanoBiology, Université de Washington à St. Louis, St. Louis, MO, États-Unis

Guy M. Genin

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SS et RG ont conçu le projet. RG, SS, IG, SG, GAS, PS, BAP, JJM et GMG ont conçu les expériences. RG a synthétisé les nanolabels et réalisé les expériences. RG et PG ont configuré les bandes LFA. SW et RG ont effectué les calculs mathématiques pour RMC et ont écrit le code requis pour les calculs des paramètres RMC. AM a développé le scanner portable/portable. QJ a configuré les LFA à bande complète et les nanolabels requis. RG et JJM ont effectué des immunoessais à flux latéral d'anticorps SARS-CoV-2. RG et ZW ont effectué des immunoessais d'anticorps SARS-CoV-2. RG et AS ont effectué des dosages immunologiques de l'antigène SARS-CoV-2 et analysé des échantillons d'écouvillonnage nasal. RG et SW ont réalisé les expériences avec le scanner portable et le traitement ultérieur des données. RG, SS, IG, SG, GAS, BAP, JJM et GMG ont analysé les résultats. RG, SS et GMG ont rédigé l'article. Tous les auteurs ont examiné et commenté l'article.

Correspondance à Srikanth Singamaneni.

JJM et SS sont des inventeurs titulaires d'un brevet provisoire lié à la technologie du fluor plasmonique, et la technologie a été concédée sous licence par l'Office of Technology Management de l'Université de Washington à St. Louis à Auragent Bioscience LLC, qui développe des produits à base de fluor plasmonique. JJM et SS sont co-fondateurs et actionnaires d'Auragent Bioscience LLC. JJM et SS ainsi que l'Université de Washington peuvent avoir un gain financier grâce à Auragent Bioscience LLC grâce à cet accord de licence. AM, QJ et AS travaillent actuellement avec Auragent Bioscience LLC. Ces conflits d'intérêts potentiels ont été divulgués et sont gérés par l'Université de Washington à St. Louis. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Biomedical Engineering remercie David Walt et Daming Wang pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

( a ) Images de fluorescence dose-dépendantes de la membrane de nitrocellulose correspondant à différentes concentrations de solutions de protéines N acquises à partir de LFA de protéine N à base de fluor plasmonique et mesurées par ( b ) scanner de table et ( c ) scanner portable.

Illustration schématique de la bandelette complète IL-6 p-LFA utilisée pour la détection quantitative d'IL-6 dans le sérum d'individus positifs au COVID-19 (confirmés par PCR).

Exemples représentatifs de traitement de données effectué sur des données acquises par scanner portable à partir de bandes IL-6 p-LFA exposées à l'échantillon de sérum (a, b) des individus PCR-positifs et (c, d) à blanc pour l'analyse quantitative de l'IL-6 concentration.

Méthodes, figures, tableaux et références supplémentaires.

Springer Nature ou son concédant (par exemple une société ou un autre partenaire) détient les droits exclusifs sur cet article en vertu d'un accord de publication avec le ou les auteurs ou autre(s) titulaire(s) des droits ; l'auto-archivage par l'auteur de la version manuscrite acceptée de cet article est uniquement régi par les termes de cet accord de publication et la loi applicable.

Réimpressions et autorisations

Gupta, R., Gupta, P., Wang, S. et al. Essais à flux latéral ultrasensibles via des nanoparticules fluorescentes conjuguées à des anticorps plasmoniquement actifs. Nat. Biomédical. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-022-01001-1

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Reçu : 14 janvier 2022

Accepté : 20 décembre 2022

Publié: 02 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41551-022-01001-1

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